更新时间：2024-11-22 14:15:56 浏览次数：：250
游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）是游离于细胞外的DNA片段，通常来源于细胞凋亡、坏死或主动释放，广泛存在于人体血液、尿液、脑脊液、胸腹水、卵泡液、唾液等各类体液中。由于cfDNA在体液中相对稳定且携带丰富的遗传和表观遗传信息，体液样本又易于收集，因此cfDNA被认为是疾病预防、诊断、治疗和预后的理想生物标志物。cfDNA在无创产前检测、癌症、糖尿病、心血管疾病、器官移植、自身免疫性疾病和败血症等领域均具有广泛的研究或应用。 与cfDNA分析相关的分析前变量涉及到众多环节，如准备工作、收集、运输、临时保存、处理、提取、质量控制和长期储存等。每个环节都涉及各种条件或细节，变量之间又相互影响。已发表的许多研究在材料和方法部分没有充分描述cfDNA分析的分析前变量，导致分析结果的可信度存疑，方法验证效率低下。因此，建立针对cfDNA分析前变量广泛适用的标准和共识意义重大，但挑战艰巨。在这篇综述中，我们深入探讨了影响cfDNA分析的前处理变量。我们阐明了在前处理变量上可达成的共识，并分析了面临的挑战，旨在提高cfDNA分析前处理程序的标准化。 （一）样本收集前的变量 许多生物学和生理学变量在样本收集前会影响cfDNA特性，且这些变量通常相互关联，存在显著的个体内和个体间差异。由于这些变量很少被单独研究，所以他们极少被关注。可能影响cfDNA特性的潜在生物学和生理学变量主要有人口统计学差异（如年龄和性别）、生活习惯（如饮食和运动）、身心状态（如肥胖、压力和情绪）、生理过程（如月经和怀孕）、感染、病理性疾病（如糖尿病、癌症、免疫障碍和炎症）等。 （二）样本采集 （1）血液采集 血液样本是最常见的用于cfDNA分析的样本。由于血浆可以避免白细胞溶解释放的基因组DNA（gDNA）对cfDNA浓度和纯度的影响并且具有更高的检测灵敏度，它常优先作为cfDNA分析的样本类型。 血液采集首先要选择合适的采血管，关键在于抗凝剂。EDTA作为抗凝剂，不仅能够抑制DNA酶并且对于延迟处理的血液比肝素或柠檬酸盐作为抗凝剂具有更好的保存效果，因此EDTA采血管被认为是用于cfDNA分析的标准采血管。在EDTA采血管中收集并在6小时内处理的血浆样本适合于循环肿瘤DNA（ctDNA）分析。但是，当血液处理因长途运输或其他不可避免的情况而延迟时，普通采血管的保存效果就十分有限了。 近年来各种专用采血管已被广泛开发用于cfDNA分析，这些采血管虽在规格上略有不同，但它们可以延长血液样本的临时保存时间，并且不需要特别控制保存温度。有研究人员将它们相互比较或与EDTA采血管进行比较，这些专用采血管在防止gDNA污染和延长储存时间方面优于EDTA采血管，并且它们在3天内都能很好地保持cfDNA的质量。 血液样本采集过程中一些可能会影响cfDNA分析的细节常常被忽略，例如过细的针头会导致溶血，抽血过程中止血带应正确放置且放置持续时间通常应在1分钟内，否则会导致血液浓缩或溶血。 （2）尿液采集 尿液的采集会根据不同研究目的选择不同类型的尿液样本（24小时尿和随机尿常用于尿生化参数的检测，晨尿常用于提取肿瘤标记物），晨尿的总cfDNA含量更稳定，是cfDNA分析的首选。 尿液在采集过程中应当选择无菌且防渗漏的采集容器，采集后最好立即分成多个小份来避免冻融对cfDNA质量的影响。使用EDTA采血管可以延长血液的保存时间也给尿液的保存带来启发，向采集后的尿液中立即添加保护剂可以增强cfDNA的稳定性，EDTA是目前最常用的保护剂。 （三）样本处理前的运输 （1）血液运输 在血液样本运输过程中，应避免明显或长时间的振动。剧烈振动可能会导致血液样本出现溶血，引起细胞代谢物的释放，从而抑制Taq酶的活性并降低PCR扩增效率。短途运输可选用EDTA采血管，4℃运输条件下的cfDNA质量比在室温条件下运输更加稳定。若需要长途运输，可选用Roche和Streck管等专用采血管，它们可以确保样本在3天内室温运输依然保持较好的质量。 （2）尿液运输 尿液样本应根据不同的运输距离来控制运输温度，对于能够确保在90分钟内处理的运输距离，样本可以在室温保存并尽快运输，对于更长的运输距离，应当使用冰袋维持低温条件或向尿液样本中添加保护剂以防止尿液物理化学性质的变化或cfDNA片段的降解。此外，尿液样本运输时应当采用质量更好的收集管且采取必要的保护措施，避免在运输过程中受到冲击或外力挤压导致尿液样本泄漏。 （四）样本处理前的暂存 血液样本处理前的储存温度和延迟处理时间会影响cfDNA的浓度、片段和纯度，使用EDTA采血管收集的血液样本应在4℃下保存，延迟处理时间不得超过24h，由专用采血管收集的血液样本可在常温下保存，延迟处理时间至少可达3天。尿液cfDNA的浓度很大程度上取决于在暂存期间添加的尿液保护剂，例如添加EDTA的尿液样本可以暂时保存更长时间，且会显著提高cfDNA的稳定性。 （五）样本处理 （1）血液处理 全血样本主要通过离心去除细胞成分来避免gDNA对cfDNA的污染，离心次数和离心力是离心方案的关键参数。目前，在血液处理过程中，获得无细胞血浆组分主要是通过二次离心来实现。第一次离心通过380–3000 g范围内的慢速离心力持续10分钟来去除大量细胞成分，第二次离心通常以12000–20000 g范围内的更快离心力持续10分钟来去除细胞残留物和碎片。 （2）尿液处理 由于尿核酸酶和污染物的存在，采集的尿液样本应尽快处理。尿液样本处理与血液样本处理类似但也存在不同，通常经历单次或两次离心来去除细胞成分或细胞碎片，并且尿液样本的离心力范围比血液样本大得多。单次离心通常需要10-20分钟，离心力范围为1000-3000 g；两次离心通常在200-2000 g离心持续10分钟后再以1800-16000 g离心持续10分钟。 （六）样本处理后提取前的暂存 血液或尿液样本在处理后通常会因为特定的实验目的或集中提取cfDNA的需要而放置于-80℃条件下临时保存。 （七）cfDNA提取 cfDNA提取方法众多，选择方法时主要考虑提取低含量cfDNA的效率、纯度、重复性以及成本，商业专用试剂盒在cfDNA提取应用中具有明显优势。提取cfDNA的商业专用试剂盒最常见方法有两种，磁性粒子新技术和旋转柱法，其中基于旋转柱的Qiagen QIAamp circulating nucleic acid kit是目前最稳定的试剂盒，但Qiagen QIAamp试剂盒在提取和纯化过程中容易丢失一些短DNA片段，使cfDNA产量降低。相比之下，基于磁性粒子的cfDNA试剂盒对短cfDNA片段（50–250 bp）有更高的回收率。 （1）用于提取血源性cfDNA的试剂盒 用于提取血液来源的cfDNA专用商业试剂盒制造商有Qiagen、Norgen、Thermo和Promega等，其中最常用的是Qiagen系列试剂盒。每个试剂盒的特点或性能存在差异，总体看各有优缺点，因此试剂盒的选择应基于特定的分析目标。如Circulating Nucleic Acids kit和QIASymphony DSP Virus kit可以从血浆中提取到各种不同片段的DNA分子，而DNA Blood Mini kit只能从血浆中提取到大片段的DNA分子。 （2）用于提取尿液样本的cfDNA试剂盒 血浆cfDNA的峰长为160-167 bp，而大多数尿液cfDNA片段小于100 bp，所以设计用于血液来源的cfDNA提取试剂盒可能不适用于提取尿液cfDNA。目前，用于提取尿液cfDNA的专用商业试剂盒制造商主要有Qiagen、Norgen、Thermo、Promega和PerkinElmer等。每种尿液cfDNA提取试剂盒都有其自身的特点和优势，因此也应根据特定研究目的来选择合适的cfDNA试剂盒。此外，由于尿液中cfDNA含量低，所以允许从大体积尿液样本（通常大于或等于10–15 mL）中提取cfDNA的试剂盒更有利于获得足够量的cfDNA。 （八）cfDNA的质量控制 检测分析前最好对提取的cfDNA进行质量评估，常用的评估技术主要有qPCR、Qubit、Femtopulse和生物分析仪等，评估指标主要包括浓度、片段大小和DNA完整性指数（DIN）等。每种方法都有优点和缺点，PCR可以精确和灵敏地检测痕量DNA，但它容易受到某些化合物的干扰。生物分析仪和Femtopulse常用于分析cfDNA的片段与浓度。 （九）cfDNA的长期储存 如果不立即进行分析，应将提取的cfDNA放置于低温储存。长期储存期间影响cfDNA质量的主要因素包括储存温度、储存时间、反复冻融和冻存管材质。其中，cfDNA通常在-20℃或-80℃条件下长期储存，但合适的储存温度取决于后续应用的要求，例如用于定量和断裂分析的cfDNA在-20℃下储存不应超过3个月，而用于突变分析的cfDNA在-20℃或-80℃条件下储存可长达9个月。最好使用聚丙烯管储存cfDNA，因为这种材质吸收的DNA较少。此外，冷冻后的cfDNA冻融循环次数不要超过3次。
